اصلاح نباتات

پايان نامه كارشناسي ارشد اصلاح نباتات

اصلاح نباتات

                                            فهرست مطالب                                        

فصل اول: مقدمه

مقدمه ------------------------------------------------------------ 2

  فصل دوم: بررسي منابع                

10 كلزا

2-1- خصوصيات كلي وعمومي كلزا---------------------------------------  10  

2-1-1- تاريخچه ومبدا ژنتيكي گياه كلزا------------------------------------ 10

2-1-2- خصوصيات گياه شناسي كلزا-------------------------------------   10

2-1-3- كشت و توليد كلزا--------------------------------------------   11

2-1-4- برداشت كلزا------------------------------------------------   13

2-1-5- ارقام وگونه هاي كلزا------------------------------------------   14

2-1-6- مهمترين گونه هاي جنس براسيكا----------------------------------   16

2-1-7- اهميت اقتصادي وصنغتي كلزا-------------------------------------   17

2-2- اصلاح گياه كلزا------------------------------------------------   18

2-2-1- روشهاي اصلاح كلزا-------------------------------------------   18

2-2-2- اهداف اصلاحي كلزا-------------------------------------------   19

2-3- گياهان هاپلوئيد-------------------------------------------------  20

2-3-1- مزايا و كاربردهاي هاپلوئيدها--------------------------------------  21

2-3-2- مشكلات ومحدوديت هاي هاپلوئيدها--------------------------------  22

2-3-3- روشهاي توليد گياهان هاپلوئيد-------------------------------------  23

2-3-3-1- توليد خود به خودي (روشهاي طبيعي)-----------------------------   23

2-3-3-2- توليد القايي(روشهاي آزمايشگاهي)-------------------------------   24

2-3-3-2-1- آندروژنز(نرزايي)-----------------------------------------   24

2-3-3-2-1-1- كشت بساك-------------------------------------------  25

2-3-3-2-1-2- كشت ميكروسپور---------------------------------------  25

2-3-3-2-2- ژينوژنز(كشت تخمدان وتخمك)-------------------------------  26

2-3-3-2-3- روش حذف كروموزومي-------------------------------------  27

2-4- كشت ميكروسپورهاي جدا گرديده كلزا---------------------------------  28

2-5- عوامل موثر بر رويانزايي ميكروسپورهاي جدا گرديده كلزا--------------------- 29

2-5-1- شرايط رشد، فيزيولوژي و ژنوتيپ گياه مادري--------------------------- 29

2-5-2- اندازه غنچه--------------------------------------------------  32

2-5-3- مراحل تكاملي ميكروسپورها--------------------------------------- 33

2-5-4- تراكم ميكروسپور در محيط كشت-----------------------------------  35

2-5-5- تركيب محيط كشت--------------------------------------------  36

2-5-6- دما-------------------------------------------------------   40

2-6- مكانيسم رويانزايي-----------------------------------------------  43  

2-6-1- مقدمه-----------------------------------------------------   43

2- 6-2- تقسيم قرينه هسته والقائ رويانزايي---------------------------------  45

2-6-3- حوادث چرخه سلولي در طي رويانزايي ميكروسپورها---------------------  47

2-6-4- خانواده هاي ژني درگير با رويانزايي ميكروسپورها در كلزا-----------------    47

2-7- عوامل موثر بر باززايي گياه از رويانهاي هاپلوئيدي كلزا----------------------   48

2-7-1- بلوغ ،مرحله رشد ونمو رويانها------------------------------------   48

2-7-2- اندازه رويانها--------------------------------------- ---------  49  

2-7-3- محيط كشت------------------------------------------------   50

2-7-5- BAP وژيبرليك اسيد-------------------------------------------  50  

2-7-6- استفاده از كاغذ فيلتر در محيط كشت يا زراعي-------------------------  51  

2-7-7- زغال فعال-------------------------------------------------- 51

2 -7-8- تيمار ABA و ابگيري رويانها-------------------------------------  51

2-8-  موارد استفاده از كشت ميكروسپوركلزا--------------------------------  56

2-8-1- اصلاح نباتات و مهندسي ژنتيك-----------------------------------  56

2-8-2- موتا سيون و انتخاب ------------------------------------------  56

2-8-3- كشت ميكروسپوروتكنولوژي  بذر مصنوعي---------------------------  57

2-8-4- سيستم كشت ميكروسپور در مطالعات فيزيولوژيكي و بيوشيميايي------------- 57

2-8-5- استفاده در كشت و امتزاج پروتوپلاستها-----------------------------  57                                                        

 فصل سوم: مواد و روشها                                  

3-1- مواد گياهي-------------------------------------------------- 60  

3-2- كشت بذور-------------------------------------------------- 60

3-3- شرايط اتاق رشد----------------------------------------------   60

3-4- مراقبت هاي زراعي--------------------------------------------   61

3-5- برداشت غنچه ها وتعيين مرحله مناسب ميكروسپورها جهت جنين زايي---------  61

3-6- محيط هاي كشت، ايزولاسيون وباززاييدر كشت ميكروسپورهاي كلزا-----------  62

3-6-1- محيط ايزولاسيون ميكروسپورها----------------------------------  62

3-6-2- محيط كشت ميكروسپورها-------------------------------------   62

3-6-3-1- استريل كردن محيط كشت ميكروسپورهاي كلزا---------------------   62

3-6-4- محيط كشت باززايي ، جنين هاي حاصل از كشت ميكروسپورهاي كلزا-------   63

3-6-5- وسايل مورد نياز جهت كشت ميكروسپورهاي كلزا---------------------   68

3-7- روش انجام آزمايش كشت ميكروسپورهاي كلزا-------------------------   69

3-7-1- برداشت غنچه ها--------------------------------------------   69

3-7-2- استريل كردن غنچه ها-----------------------------------------  69

3-7-3- استخراج ميكروسپورها----------------------------------------- 69

3-7-4- تعيين تراكم ميكروسپورها--------------------------------------- 70

3-8- آزمايشات انجام شده--------------------------------------------  71

3-8-1-مطالعه اثرتراكمهاي مختلف ميكروسپوربرروي جنين زايي ميكروسپورهاي كلزا---- 71

3-8-2- مطالعه باززايي گياه در جنين هايي با اندازه هاي مختلف حاصل از كشت

ميكروسپورهاي كلزا-------------------------------------------------  72

3-8-3- مطالعه اثراستفاده از كاغذ صافي يا كاغذ فيلتردر ميزان ريشه زايي ،ارتفاع گياهچه ها

ودرصد گياهچه هاي نرمال--------------------------------------------- 73

3-8-4- مطالعه  اثر استفاده ازشوك سرمايي  بر روي  درصد تشكيل  گياهچه هاي طبيعي--  74

3-8-5- تعين سطح پلوئيدي گياهچه هاي باززايي شده--------------------------  75

3-9- تجزيه و تحليل داده ها--------------------------------------------  78                      

فصل چهارم:نتايج وبحث    

4-1- جنين زايي ميكروسپورهاي كلزا در تراكمهاي مختلف ميكروسپور در محيط كشت---- 82

4-2- اثراندازه هاي مختلف جنين برروي صفات باززايي جنين هاي حاصل ازكشت

ميكروسپورهاي كلزا--------------------------------------------------  84

4-3- اثراستفاده ازكاغذ صافي يا كاغذ فيلتردر ميزان ريشه زايي ،ارتفاع گياهچه ها

ودرصد گياهچه هاي نرمال--------------------------------------------- 90

4-4- اثر استفاده ازشوك سرمايي  بر روي  درصد تشكيل  گياهچه هاي طبيعي----------  97

4-5- پيشنهادات---------------------------------------------------  105

منابع مورد استفاده-------------------------------------------------- 107

•    فصل اول: مقدمه

• مقدمه :

گياه كلزا مهمترين گونه زراعي جنس براسيكا (Brassica) ميباشد. و ويژگيهاي خاص اين گياه يعني قابليت كشت در نقاط مختلف ، در صد بالاي روغن آن ، كيفيت مطلوب روغن ، كاربرد روغن آن در صنايع نساجي و پلاستيك و نيز استفاده از كنجاله آن در تغذيه دام سبب شده است كه توسعه كشت اين گياه بعنوان نقطه اميدي جهت تامين روغن خام مورد نياز كشور و رهائي از وابستگي بشمار رود .بطوريكه در حال حاضر كلزا نقطه ثقل طرحهاي افزايش توليد دانه هاي روغني محسوب ميگردد. دانه‎هاي روغني قسمت مهمي از توليد محصولات كشاورزي را شامل مي‎شوند، چون علاوه بر مصارف صنعتي از لحاظ تغذيه نيز اهميت بسزايي دارند. سطح زير كشت دانه‌هاي روغني در سال  1383  (بجز كنجد كه در سيستم روغن كشي وارد نمي‌شود) 319 هزار هكتار و محصول توليد شده (دانه) حدود 400 هزار تن بوده ‌است. مصرف روغن نباتي در سال 1383 بالغ بر 1180 هزار تن بوده‌است كه 170 هزار تن از آن معادل حدود 4/14 درصد، از توليد داخل تامين شده ‌است ( بي نام ، 1382 ).  كلزا به عنوان يك گياه روغني با بيش از 40% روغن در دانه از گياهان مهم جهت توسعه كشت نباتات روغني وتوليد روغن نباتي در ايران است. كلزا با نام علمي Brassica napus  و نام انگليسي Rapeseed گياهي از تيره Brassicacea  ( چليپائيان يا شب بو ) مي‎باشد كه پس از سويا و نخل روغني مقام سوم را در تأمين روغن نباتي جهان به خود اختصاص داده است كه در حدود 7/14% كل توليد روغن نباتي جهان را تأمين مي‎كند. اين گياه در برابر خشكي و سرما مقاوم بوده و به دليل سازگاري، دامنه كشت وسيعي دارد  ( دهشيري 1378 ). روشهاي سنتي (كلاسيك) اصلاح نباتات از دير باز براي توليد گياهان زراعي برتر مورد استفاده قرار ميگرفته است كه مبتني بر ايجاد تغيير در ساختار ژنتيكي گياه كامل در جهت هدف خاصي با استفاده از تلاقيهاي بين جنسي ودرون جنسي بوده است.

روشهاييكه جهت اصلاح گياهان خود گشن بكار گرفته ميشوند٬ عمدتا روشهاي گزينش (Selection) و يا دورگ گيري (Hybridization) است كه در مورد اول از تنوع ژنتيكي موجود در توده هاي طبيعي و بومي استفاده شده و واريته هاي اصلاح شده اي كه نسبت به جامعه اوليه برتري هائي از نظر كمي و كيفي دارند بوجود مي آيند. شانس موفقيت در اين روش نسبتا كم است زيرا به غناي ژنتيكي توده هاي محلي بستگي دارد كه امروزه رو به كاهش بوده و كمتر قابل دسترسي است. در مقابل روشهاي مبتني بر تلاقي به اصلاحگر اين امكان را ميدهد كه بطور هدفدار صفات مطلوب واريته هاي مختلف را با يكديگر تلفيق نمايد(Poehlman and Mitton , 2003).

يك پروژه اصلاح نباتات از زمان انجام دورگ گيري تا آماده شدن واريته جهت كشت ، حدودا 10 تا 15 سال زمان صرف مي شود لذا امروزه متخصصين اصلاح نباتات به دنبال روشهائي هستند كه بتوان اين مدت زمان را به حداقل ممكن رسانيد تا در وقت و هزينه هاي سنگين برنامه هاي اصلاح نباتات صرفه جوئي شود. براي اين كار سعي بر اينست كه بتوان با ايجاد تغييرات ژنتيكي در سطح سلول ، زمان لازم براي تهيه ارقام پر محصول با كيفيت بالا و مقاوم به بيماري و يا تنشهاي محيطي را در برنامه هاي به نژادي كوتاه كرد(اصلاني و همكاران ، 1381).

كلزا گياهي‎ خودگشن‎-‎ دگرگشن مي‎باشد ودرصد دگرگشني آن در ارقام مختلف بين 33%-22% گزارش شده است ( شهيدي و فروزان ، 1376 ). اين گياه آلوتتراپلوييد (38=x4=n 2) مي‎باشد.روشهاي سنتي اصلاح نباتات در چند دهة اخير نقش بسيار مهمي در اصلاح عملكرد و كيفيت كلزا داشته اند كه از ميان اين روشها مي توان به روش انتخاب توده اي[1] و گزينش شجره اي[2]  اشاره كرد. از معايب اين روشها طولاني بودن دورة آنها مي باشد. امروزه متخصصين اصلاح نباتات به دنبال روشهاي ديگري هستند كه بتوانند اين مدت را به حداقل ممكن برسانند تا در وقت و هزينه هاي سنگين برنامه هاي اصلاح نباتات صرفه جويي شود.  يكي از اين روشها اصلاح از طريق سيستم دابل هاپلوئيدي[3] مي باشد، كه به عنوان وسيله اي براي تركيب صفات يك تلاقي مي تواند مكمل روش شجره اي باشد. اهميت استفاده از گياهان هاپلوئيد در برنامه هاي اصلاح نباتات از مدتها پيش براي دانشمندان مسلم گرديده است و يكي از موضوعات مهم تحقيقاتي در اين زمينه، توليد لاينهاي هموزيگوس جهت توليد گياهان هيبريد در گونه هاي خودناسازگار مي باشد. با توليد لاينهاي كاملاً هموزيگوت در اين روش 5-3 سال در زمان برنامه هاي اصلاحي صرفه جويي مي شود. سيستم دابل هاپلوئيدي در صورتي موفق است كه به توان گياهان هاپلوئيد ودابل هاپلوئيد توليد كرد، بدين منظور قبل از استفاده از اين سيستم آزمايشاتي را در جهت  بهينه سازي گياهان مي بايست انجام داد. روشهاي متعددي جهت توليد گياهان هاپلوئيد و به دنبال آن گياهان دابل هاپلوئيد وجود دارد كه يكي از اين روشها آندروژنز[4] مي باشد.

آندروژنز به دو روش انجام مي شود : الف ـ كشت بساك[5] ب ـ كشت ميكروسپور[6] . كشت ميكروسپور اخيراً به لحاظ مزاياي آن بر كشت بساك، مورد توجه قرار گرفته است. در اين روش امكان توليد تعداد زيادي گياهان هاپلوئيد وجود دارد. توليد سريع لاينهاي خالص از ميكروسپورهاي جدا شده، مهمترين ويژگي اين روش در برنامه‌هاي اصلاحي مي باشد. همچنين با توجه به فراواني بالاي توليد گياه از كشت ميكروسپور و نيز سهولت انتقال ژن ، كشت ميكروسپور ، كارآمدترين و بهترين اندام هدف در انتقال ژن به شمار مي آيد و دانشمندان اميدوارند كه در آينده اي نزديك از  اين روش به عنوان يك روش متدوال در مهندسي ژنتيك استفاده نمايند. ميكروسپورهاي گياهان F₁ مي توانند لاينهاي دابل هاپلوئيد بسياري توليد كنند تا براي تركيب مطلوبي از صفات گزينش شوند. لاينهاي انتخابي، كاملاً خالص هستند و از نظر يكنواختي و پايداري براي به نژادگران مشكلات كمتري به دنبال دارند .(Mohan Jain et al., 1996)  توليد رويانهاي هاپلوئيد و به دنبال آن توليد گياهان دي هاپلوئيد در كلزا از اهميت ويژه اي برخوردار مي باشد . در طبيعت توليد گياهان هاپلوئيد به صورت خود‎به‎خودي، درگونه‏هاي Brassica در فراواني بسيار  پايين  (حدود 4/19-05/0 در هزار گياه ) اتفاق مي‎افتد ( Banga and Labana , 2003 ) . اما به هر جهت بهره وري واقعي از هاپلوئيدهاي ردهBrassica   با كشف روشهاي القاء رويان از بساكها و ميكروسپورهاي جدا شده در شرايط درون شيشه اي آغاز گرديد . گياهان هاپلوئيد زيادي بطور رايج توسط كشت بساك يا ميكروسپورهاي جدا شده توليد مي شوند، اگرچه تنوع قابل ملاحظه اي بين گونه‎ها ، واريته‎ها و ارقام مختلف وجود دارد ، اما تكنيكهاي كشت ميكروسپور جدا شده و كشت بساك به طور موفقيت‎آميزي براي اكثرگونه‎ها و واريته‎هاي تجاري رده Brassica استفاده شده است و در سالهاي اخير پيشرفتهاي چشمگيري در اين زمينه بدست آمده است ، به طوريكه ‎ رويان زايي ميكروسپور در B. napus يكي از كامل‎ترين سيستم‎ها براي توليد گياه در شرايط درون شيشه اي[7] است((Burnett  et al., 1992  .

تكنيك باززايي گياه از رويانهاي حاصل از كشت ميكروسپور براي اصلاح نباتات و مهندسي ژنتيك ضروري است اما گزارش شده است كه اكثر رويانها به گياهچه تبديل نمي‌شوند و به صورت غير طبيعي باززايي مي‌شوند يا اينكه رويانهاي ثانوي را تشكيل مي‌دهند. ( Takahata,1997 )   همچنين عدم باززايي يا باززايي بسيار اندك رويانهاي هاپلوئيد به خصوص در كشت پرچم نيز گزارش گرديده است      ( Bruins and Snijder, 1995 ) .  در ايران ، براي اولين مرتبه آزمايشاتي در زمينه رويان زايي و باززايي در قالب پايان‎نامه كارشناسي‎ارشد در دانشكده كشاورزي دانشگاه تربيت مدرس انجام شد ‎‎كه موفقيت چشمگيري نيز حاصل شد. در اولين  تحقيق ( باقري ، 1379 )، سه رقم بهاره  ( F704, Global, Maluka ) وسه رقم پاييزه كلزا  (Ceres  Slmo46, Bounty, ) از لحاظ پاسخ به كشت ميكروسپور مورد ارزيابي قرار گرفتند كه در دو آزمايش هيچ روياني بدست نيامد، اما در آزمايش آخر، از 36 پتري‎ديش كشت شده حدود 20 رويان حاصل شد و رقم Bounty در رويان زايي و  باززايي گياه، به عنوان بهترين ژنوتيپ شناخته شد. در تحقيق ديگر ( خنجي ، 1380 )، پاسخ به كشت ميكروسپورهاي جدا شده كلزا در يك رقم بهاره ( Global ) و دو رقم پاييزه ( Okapi و  Colvert )  مورد بررسي قرار گرفت. رقم Global  به عنوان بهترين رقم در بين ارقام استفاده شده از نظر پاسخ دهي به كشت ميكروسپور كلزا شناخته شد و در هر پتري‎ديش كشت شده، حدود 22% رويان بدست آمد. در تحقيق ديگر ( عبدالهي ، 1381 )، اثر تراكم، اثر شوك حرارتي و اثر تعويض محيط كشت بر روي رويان زايي، واثر اندازه هاي مختلف رويان بر روي باززايي گياه در رقم بهاره كلزا  ( Global ) مطالعه شد. در اين تحقيق، بالاترين ميزان رويان زايي در تراكم 40000 ميكروسپور در هر ميلي‌ليتر محيط كشت بدست آمد. تعويض محيط كشت، ميزان رويان زايي ميكروسپورهاي كلزا را در تراكم هاي مختلف ميكروسپور افزايش داد و رويانهاي5  ميليمتري، بهترين باززايي را نشان دادند. در تحقيق ديگر ( حبيبي ، 1382 )، اثر حجمهاي مختلف محيط كشت بر روي رويان زايي و اثر شوك حرارتي و زغال فعال بر روي باززايي گياه رقم بهاره كلزا ( PF )  مطالعه شد. در اين تحقيق، بالاترين ميزان رويان ‌زايي در پتري‌ديشهايي با قطر cm 10 و حجمهاي محيط كشت ml 5/12 و ml 10 بدست آمد. همچنين مقايسه ميانگين اثر غلظتهاي مختلف زغال فعال در محيط كشت باززايي بر روي درصد تشكيل گياهچه‌هاي طبيعي نشان ‌داد، كه غلظتهاي مختلف زغال فعال در سطح 5% با هم اختلاف معني‌داري را نشان مي‌دهند، بطوريكه ميزان l^-1 g 125/0 زغال فعال با توليد 40% گياهچه كاملاً طبيعي، در گروه a قرار گرفت .

در اين تحقيق سعي بر اين است تا شرايط براي  باززايي گياهان حاصل از رويانهاي بدست آمده از ميكروسپورها بهينه ‎سازي شود، براي اين منظور اثرات مختلف شوكهاي سرمائي و نيز آبگيري رويانها و اثر استفاده از كاغذ صافي مورد آزمايش و مطالعه قرار گرفت ،  تيمار آبگيري رويانها  با تسريع در بلوغ رويانها ( Wang et al., 2002 ) ، درصد باززايي گياهان را افزايش مي دهند. در ارتباط با مطالعه اثرشوكهاي سرمائي، سرماي هوا نيز مي تواند بر روي تبديل رويان به گياه موثر باشد.

در هنگام انجام اين تحقيق سوالهائي از قبيل سوالات ذيل مطرح بودندكه پاسخ به آنها به تفصيل در قسمت مربوطه آورده شده است                                                                                                                                  

1- آيا اعمال شوكهاي سرمائي  مي‎تواند اثر معني داري بردرصد باززايي گياهان كلزاي مورد مطالعه داشته باشد ؟

2- آيا استفاده از كاغذ صافي  مي‎تواند اثر معني داري روي درصد باززايي گياهان كلزاي مورد مطالعه داشته باشد؟

3- آيا اثر تراكمهاي مختلف ميكروسپورها بر روي جنين زائي ميكروسپورهاي كلزا اثر معني داري دارد؟

4- آيا باززائي گياه سبز در جنين هائي با اندازه هاي مختلف حاصل از كشت ميكروسپورهاي كلزا با  هم تفاوت معني داري دارند؟

 فصل دوم: بررسي منابع                

كلزا:

2-1 : خصوصيات كلي و عمومي كلزا :

2-1-1 : تاريخچه و مبدأ ژنتيكي گياه كلزا  :

طبق نظر محققين خاستگاه گياه كلزا نواحي آسيا و اروپا مي‌باشد . زيرا زيرگونه‌هاي متعلق به شلغم روغني به صورت وحشي از اروپاي غربي تا چين پراكنده شده اند ، پس مي‌توان نتيجه گرفت كه اين گياه داراي دو موطن يكي در ناحيه افغانستان و پاكستان و ديگري در ناحيه مديترانه‌ مي‎باشد (دهشيري ، 1378‌ ). اعتقاد بر اين است كه B. napus  بايد از جنوب اروپا منشا گرفته و در  اوايل قرن 18 از آنجا به آسيا وارد شده باشد

 (  Downey and Robbelem , 1989) .

زراعت كلزا از 3000 سال قبل در هندوستان رواج داشته و از آنجا به چين و ژاپن راه يافته است.  در اروپا استخراج روغن از دانه كلزا و دانه ساير گونه هاي متعلق به جنس Brassica دست كم از قرن 16 رواج داشته است، اين روغن ابتدا به عنوان روغن چراغ استفاده مي‌شد و سپس به عنوان روغن خوراكي مرسوم گرديد.  توليد تجاري كلزا در سال 1942 به عنوان منبع تامين كننده روغن روان ساز در جنگ جهاني دوم  آغاز گرديد ، اما به دليل قحطي و گرسنگي و كمبود منابع روغن خوراكي مقداري از آن به مصرف غذايي رسيد و پس از آن با توجه به امكان استفاده خوراكي ازاين روغن ، اصلاح آن موردتوجه قرار گرفت(عزيزي و همكاران ، 1378 ) .

2-1-2 : خصوصيات گياه شناسي كلزا :

كلزا[1] با نام انگليسي(n 2=x 4 = 38 (  Rapeseed گياهي از خانواده Cruciferae يا Brassicaceae (چليپائيان يا شب ‌بو) با نام علمي Brassica napus L. مي‌باشد.

از نظر گياهشناسي، كلزا گياهي علفي با دوره رشد يكساله مي‌باشد و داراي ريشه اصلي و بلندي است كه در شرايط مناسب تا عمق 80 سانتي متري خاك و حتي بيشتر نيز نفوذ مي كند.  كلزا داراي يك ساقه اصلي و تقريبا مدور مي باشد كه پس از به گل نشستن ساقه اصلي رشد ساقه فرعي آغاز مي شود و تعداد زيادي شاخه فرعي از آن منشعب مي شود.  گل آذين به شكل خوشة بلندي است كه در آن گلها از قسمت پائين خوشه شروع به شكفتن مي كنند. كلزا گياهي خودگشن است كه ميزان خودگشني آن بيش از 70 % مي باشد.  ميوه كلزا غلاف يا خورجيني به طول 5 تا 10 سانتي متر مي باشد كه فاقد كرك است. كلزا يك گياه سرما دوست و روز بلند است و بهترين رشدآن درهواي خنك و دماي20-15درجه سانتيگرادمي باشد(عزيزي و همكاران ، 1378 ).

2-1-3 : كشت و توليد كلزا :

فعاليت در زمينه كشت و زرع كلزا در ايران اولين بار توسط شركت توسعه دانه‌هاي روغني آغاز شده بطوريكه فعاليتهاي ترويجي ابتدا  روي رقم سوئدي اورو ( Oro ) كه كلزايي از گروه يك صفر و جزء ارقام بهاره بود ، انجام شد ولي به دليل عدم موفقيت و بالابودن استاندارد روغن ، گسترش اين رقم محدود گرديد ( شهيدي، و فروزان ، 1376 ).

مهم‌ترين كشور‌هاي توليد كننده كلزا را چين ، كانادا ،‌ هند و سپس كشور‌هاي اروپايي تشكيل مي‌دهند . اين گياه رابطه نزديكي با ساير نباتات اين خانواده از جمله شلغم ، كلم ، كلم بروكلي و خردل دارد .

سطح زير كشت دانه‌هاي روغني در سال  1383  ( بجز كنجد كه در سيستم روغن كشي وارد نمي‌شود ) 319 هزار هكتار و محصول توليد شده ( دانه‌ ) حدود 400 هزار تن بوده ‌است . مصرف روغن نباتي در سال 1381 بالغ بر 1180 هزار تن بوده‌است كه 170 هزار تن از آن معادل حدود 4/14  درصد ،  از توليد داخل تامين شده ‌است.

در سال زراعي 84 – 83 متوسط عملكرد زراعت كلزا نسبت به 3 سال گذشته 5 برابر افزايش يافته است و عملكرد زراعت كلزا در اين سال ( 84 – 83 ) نسبت به سال اول شروع طرح (79 -78 ) حدود 5/6 برابر افزايش يافته است كه نتيجه اي بسيار مطلوب است. بالا ترين ركورد عملكرد زراعت كلزا در  سال 79 – 78 با بازده بالا3700 كيلوگرم بوده است، در حاليكه در سال جاري در حدود 7296 كيلوگرم بود و بطور كلي توليد كلزا در سال زراعي84 – 83  با 63درصد افزايش نسبت به سال 81-82 به ۱۱۲ هزار تن رسيده است. سطح برداشت كلزا در سال جاري 83 –84  با 57/5درصد افزايش نسبت به سال82-83 به71400 هكتار رسيد و اين در حالي است كه سطح برداشت در سال زراعي 82-81 حدود 48400هكتار بود ( بي نام، 1382 ) .  در سال زراعي84 – 83 ، 24000   هكتار از اراضي استان  مازندران به كشت كلزا اختصاص يافته بود كه جمعا 37000 تن محصول نيز از اين سطح برداشت شد . همچنين 2500 هكتار از اراضي شهرستان ايلام  ،1500 هكتار از اراضي شهرستان آبدانان ( در 180 كيلومتري مركز ايلام )، 490  هكتار از اراضي شهرستان زنجان ، 200 هكتار از اراضي شهرستان اردستان ( شمال اصفهان )، 156 هكتار از اراضي شهرستان رشت و30 هكتار از اراضي دشت پلنگ در شهرستان  دشتي به كشت كلزا اختصاص يافته بود . در همدان ، قزوين ، كرمانشاه ، خرم آباد و چهار محال وبختياري كشت كلزا نيز صورت گرفت.   قيمت پيشنهادى خريد دولت به مبلغ سه هزار و110 ريال با اختصاص 240 ريال يارانه به ازاي هر كيلوگرم كلزا، مي باشد (جدول 2 – 1). هزينه كاشت هر هكتار كلزا بين يك ميليون و پانصد هزار تا دو ميليون و پانصد هزار ريال مي باشد كه سود حاصله در هر هكتار كلزاكاري 3 ميليون تا 5 ميليون ريال است ( بي نام، 1382 ) .رشد سالانه توليد كلزا در دهه اخير ازسويا ، پنبه‌دانه ، آفتابگرادان و بادام زميني بيشتر بوده است. افزايش جمعيت دنيا و بهبود استاندارد‌هاي زندگي موجب افزايش توليد كلزا براي مصارف روغن خوراكي خواهد شد.

جدول 2 – 1  : سطح زير كشت ، توليد ، عملكرد  در هكتار و قيمت هر كيلوگرم  دانه‌هاي روغني در ايران در سال 84 - 1383 ( بي نام، 1382 )

2-1-4 : برداشت كلزا:

     كلزا زماني آماده برداشت مي باشد كه ساقه ها و غلاف ها زرد رنگ شده و دانه ها به رنگ تيره درآمده باشد و در صورت تكان خوردن ريزش كنند. دانه ها  در اين مرحله بايستي حدود 15 % رطوبت داشته باشند، اين مدت براي كشت بهاره90-120روز وبراي كشت پاييزه180-240روز بعد از كشت است.كلزا سريع مي رسد بنابراين سريع مي بايست برداشت شود در غير اينصورت دانه ها ريزش مي كنند، به همين جهت در بعضي مناطق آنها را مانند كنجد قبل از زمان برداشت بريده و در محلي نگاهداري مي كنند تا رطوبت دانه ها كاهش يابد وسپس آنها را كمباين مي كنند.

2-1-5 : ارقام وگونه هاي كلزا :  

از نظر طبقه بندي زراعي كلزا داراي دو تيپ بهاره و پاييزه مي‌باشد.  از نظر پراكنش جغرافيايي كلزا عموماٌ در اروپا و كانادا كشت مي‌شود.  ارقام بهاره و پاييزه كلزا به عنوان منبع روغن گياهي كشت مي‌شوند، ارقام پاييزه در شرايط مساعد پر محصول مي‌باشند. در اروپا و چين اغلب از ارقام پاييزه استفاده مي‌شود.  در عرضهاي جغرافيايي و ارتفاعات بالاتر و در نقاطي كه شانس بقاي گياه در زمستان كم است از ارقام بهاره استفاده مي‌شود  ( عزيزي و همكاران، 1378 ) .

گياهان جنس Brassica بر حسب ميزان اروسيك اسيد به دو گروه عمده تقسيم مي‌شوند:

1- ارقامي كه داراي مقادير زيادي  اروسيك اسيد  هستند ( در حدود 55 درصد يا بالاتر ) و باعلامت اختصاري [2]HEAR مشخص مي‌شوند و مصرف خوراكي ندارند.

2- ارقامي كه كمتر از 5 درصد  اروسيك اسيد  در روغن آنها وجود دارد و در سال 1979 تحت عنوان           [3] LEAR نامگذاري شده اند. رقم ارو[4] اولين رقم از اين دسته مي‌باشد و با انتقال ژنهاي توليدكننده اروسيك اسيد  به درون ارقام سازگار ايجاد شده است (Downey et al., 1975  ). محققين كانادايي نام كانولا[5] را براي ارقام اصلاح شده كلزا ( داراي  حداكثر 2 درصد  اروسيك اسيد  ) انتخاب نموده اند. علاوه بر  اروسيك اسيد ، ماده مضر ديگري نيز به نام گلوكزينولات در كلزا وجود دارد باعث طعم تند و بو گزنده كنجاله آن مي‌شود و فيبر نيز از موادي است كه باعث افت كيفيت كنجاله مي‌گردد.

تقسيم بندي كلزا بر اساس چگونگي اصلاح آن ، با توجه به 3 ماده  اروسيك اسيد ، گلوكزينولات و فيبر مي‌باشد ( شهيدي و فروزان، 1376 ).  يكي از بزرگترين موفقيتهايي كه در اصلاح كلزا به وقوع پيوسته است تغيير محتوي  اروسيك اسيد روغن از زياد به كم و همچنين كم كردن مقدار گلوكزينولات آن مي‌باشد.تقسيم بندي كلزا از نظر سه ماده فوق به قرار زير مي‌باشد ( شهيدي و فروزان، 1376 ) :

• كلزاهاي سنتي[6] : حاوي 60- 22 درصد اروسيك اسيد در روغن و 205 – 100 ميكرومول گلوكزينولات در هر گرم كنجاله هستند و جز ارقام HEAR محسوب مي شوند.
• ارقام يك صفر[7] ( 0 ) : در اين ارقام ميزان اروسيك اسيد به ميزان بسيار زيادي كاهش يافته است و به حدود 5 درصد رسيده است ولي ميزان گلوكزينولات آنها بالا (  205 – 100 ميكرومول در هر گرم  كنجاله مي‌باشد) ، كه هنوز هم توليد مي‌شود.
• ارقام دو صفر[8] ( 00 ) : در اين ارقام علاوه بر ميزان اروسيك اسيد كه تا حدود 2 درصد كاهش پيدا كرده است ، ميزان گلوكزينولات نيز به 30- 18  ميكرومول در هر گرم كنجاله رسيده است .  ارقام معروف به كانولا جز اين دسته محسوب مي‌شوند كه داراي 2 درصد  اروسيك اسيد  و كمتر از 30 ميكرومول گلوكزينولات در هر گرم كنجاله مي‌باشند. رقم Tower اولين رقم كلزاي دوصفر توليد شده مي باشد ( دهشيري، 1378 ).
• ارقام سه صفر[9] ( 000 ) : اين ارقام حاوي حداقل ميزان اسيد اروسيك مي باشند و از نظر مقدار فيبر نيز اصلاح شده اند و اصطلاحاً به آنها كاندل (⁴ Candle ) مي گويند.  

2-1-6 : مهمترين گونه‌هاي جنس براسيكا :  

مهمترين گونه‌هاي ديپلوئيد رده براسيكا و سرده‎هاي وابسته به آن توسط تجزيه ژنومي مشخص شده و براساس تعداد كروموزومها به شكل زير گروه‎بندي شده‌اند (Mizushima, 1950) :

X = 7: B. adpressa, B. deflexa, D. erucoides

X = 8 : B. nigra, B. fruticulosa, B. mourorum, B. spinenesis

X = 9 : B. oleracea, B. rupestris, B. macrocarpa, B. montana, B. cretica, R. sativus

X = 10 : B. Campestris, B. tournefortii, B. saxatilis, B. repanda, B. barrilirei

X = 11 : B. amplexicauli, B. elongata, B. Sativa

X = 12 : B. hirta

B = Brassica, E = Eruca, D = Diplotaxis, R= Raphanus

سه گونه ديپلوئيد زراعي براسيكا عبارتند از :

• rapa L. (syn, B. Campestris) (Aژنوم, 2n = 2x = 20) شلغم روغني
• nigra L. (B ژنوم, 2n = 2x = 16) خردل سياه
• oleracea L. (C ژنوم, 2n = 2x = 18) كلم

آمفي‌ديپلوئيدي (دو برابر شدن كروموزوم F₁ حاصل از تلاقي دو گونه ديپلوئيد) و انيوپلوئيدي (كم يا اضافه شدن تعداد كروموزوم‎هاي يك فرد)، نقش مهمي در تمايز و تكامل گونه‌هاي براسيكا ايفاء كرده‌اند و سه آمفي‌ديپلوئيد طبيعي زير از سه گونه فوق منشاء گرفته‌اند:

• napus (2n = 4x = 38, AC ژنوم) كلزا
• carinata (2n = 4x = 34, BCژنوم) خردل حبشي
• juncea (2n = 4x = 36, AB ژنوم) خردل هندي

2-1-7 : اهميت اقتصادي و صنعتي كلزا :

روغن و كنجاله دو فرآورده مهم حاصل از دانه كلزا هستند . دانه كلزا حاوي حدوداً‌ 40% روغن است ، روغن كلزا در مقام مقايسه با روغن حاصله از دانه‌هاي روغني ممتاز آفتابگردان ، ذرت و سويا به دليل حضور اسيدهاي چرب اشباع نشده و فقدان كلسترول از كيفيت تغذيه‌اي بالايي برخوردار است .

در بدو امر ، روغن اين گياه براي صنعت و روشنايي منازل بكار مي‌رفت ، امروزه در كشور‌هاي مترقي روغن برخي از ارقام خاص آن به عنوان سوخت موتور‌هاي ديزل بكار گرفته مي‌شود و بدليل تحمل حرارت بالا ، در سوخت جت نيز استفاده مي‎شود ( شهيدي و فروزان ،  1376 ).

گياه كلزا بدليل داشتن اهميت غذايي ويژه در دنياي غرب مورد توجه اصلاح‌گران قرار گرفته است ، بطوريكه كشور‌هايي همچون چين ، كانادا ،‌ هند و كشور‌هاي اروپايي نظير فرانسه ، آلمان و انگلستان در زمينه توليد اين گياه به پيشرفت‌هاي قابل ملاحظه‌اي رسيده‌اند و در مجموع 4/98 درصد توليد جهاني كلزا را به خود اختصاص داده‌اند.

از روغن كلزا در تهيه صابون نيز استفاده مي گردد . انواعي از گونه هاي كلزا كه فاقد اسيد اروسيك هستند براي تهيه مارگارين مصرف مي شوند.

2-2 : اصلاح گياه كلزا :

2-2-1 : روشهاي اصلاح كلزا :

  مهمترين روشهاي اصلاحي كه براي اصلاح كلزا به كار مي روند عبارتند از : انتخاب توده‌اي[10]، به نژادي شجره‌اي[11] ، گزينش بالك[12] ، تلاقي برگشتي[13] ، انتخاب دوره‌اي[14] ، اصلاح واريته‌هاي ساختگي[15]  و به كارگيري دورگها[16] . از معايب اين روشها طولاني بودن دورة آنها مي باشد. امروزه متخصصين اصلاح نباتات به دنبال روشهاي ديگري هستند كه بتوانند اين مدت را به حداقل ممكن برسانند تا در وقت و هزينه هاي سنگين برنامه هاي اصلاح نباتات صرفه جويي شود.  يكي از اين روشها اصلاح از طريق سيستم دابل هاپلوئيدي مي باشد، كه به عنوان وسيله اي براي تركيب صفات يك تلاقي مي تواند مكمل روش شجره اي باشد. اهميت استفاده از گياهان هاپلوئيد در برنامه هاي اصلاح نباتات از مدتها پيش براي دانشمندان مسلم گرديده است و يكي از موضوعات مهم تحقيقاتي در اين زمينه، توليد لاينهاي هموزيگوس جهت توليد گياهان هيبريد در گونه هاي خودناسازگار مي باشد. با توليد لاينهاي كاملاً هموزيگوت در اين روش 5-3 سال در زمان برنامه هاي اصلاحي صرفه جويي مي شود. سيستم دابل هاپلوئيدي در صورتي موفق است  كه  به توان گياهان هاپلوئيد و دابل هاپلوئيد توليد كرد ،  بدين منظور قبل از استفاده از اين سيستم آزمايشاتي را در جهت  بهينه سازي گياهان مي بايست انجام داد.

2-2-2 : اهداف اصلاحي كلزا :

از مهمترين اهداف اصلاحي كلزا،اصلاح براي كميت و كيفيت روغن مي باشد(Sauer and Kramer, 1983 ) . نكته‌اي كه بايد در مورد روغن به آن توجه كرد ، نوع مصرف روغن مي‌باشد(عزيزي و همكاران، 1378 ). بطوريكه اگر هدف توليد روغن خوراكي باشد ارقام با اروسيك اسيد پايين، مناسب مي‌باشند. اين ارقام ( بدون  اروسيك اسيد يا با  اروسيك اسيد پايين ) به طور طبيعي داراي 80 - 60 درصد اولئيك اسيد ،30 - 10 درصد اسيد‌هاي چرب داراي حلقه‌هاي غيراشباع و تنها 10 – 5 درصد اسيدهاي چرب اشباع شده مي‌باشند. در اين زمينه با وجود دسترسي به ژنهاي كلون شده رمزكننده اولئات مي توان از روش آنتي سنس استفاده كرد تا ميزان اسيدهاي چرب اشباع نشده روغن كلزا را كم كرده يا از بين ببرد. در توليد روغنهاي صنعتي ، هدف اصلاحگر ، توليد ارقام كلزا با  اروسيك اسيد بالا مي‌باشد . در كلزا مقدار  اروسيك اسيد توسط  دو مكان ژني كنترل مي‌شود(Kirk and Hurlestone., 2004 ). مقدار روغن تحت تاثير عوامل محيطي ( بالاخص درجه حرارت و تنش رطوبتي ) و عوامل ژنتيكي مي‌باشد (Grami et al., 1977  ). از اهداف اصلاحي ديگر مي توان به اصلاح براي بهبود كيفيت كنجاله و مقاومت به بيماريها و آفات اشاره نمود. كاهش گلوكزينولات و افزايش پروتئين از عوامل مهم در بهبود كيفيت كنجاله كلزا هستند . چندين ژن سطح گلوكزينولات را در كلزا تعيين  مي‌كنند (Demarch et al., 1989 ). در كنجاله دانه هاي روغني خانواده كلزا ( Brassica)25 - 20 درصد پروتئين با كيفيت تغذيه‌اي بالا وجود دارد . كنجاله كلزا از نظر اسيدهاي آمينه ضروري مانند ليزين و متيونين فقير مي‌باشد. تلاشهايي صورت گرفته است تا ژنهاي كدكننده پروتئينهاي ذخيره اي غني از متيونين را از گونه هايي نظير بادام برزيلي و Bertholletia excelsa به كلزا منتقل نمايند ( عزيزي و همكاران، 1378 ) .

2-3 : گياهان هاپلوئيد :

 در گياهان به هنگام توليد مثل جنسي ، در اثر تقسيم ميوز تعداد كروموزومها نصف مي شوند و در نتيجه سلولهايي با تعداد كروموزومهاي  كاهش  يافته به وجود مي آيد . اگر چنين سلولهايي بدون انجام عمل لقاح به يك گياه تبديل شوند، به آن گياه هاپلوئيد مي گويند كه سلولهاي آنها حاوي n كروموزوم خواهد بود) Pierik., 2004 ) . مدتهاي طولاني است كه مفهوم هاپلوئيد در زمينه هاي ژنتيك و به نژادي مورد توجه مي باشد ولي بهره برداري از آنها محدود باقي مانده است . زيرا اين پديده در طبيعت با فراواني بسيار كمي اتفاق مي افتد ( باقري ، 1379 ) . اهميت استفاده از گياهان هاپلوئيد در برنامه هاي اصلاح نباتات از مدتها پيش براي دانشمندان مسلم  گرديده است و يكي از موضوعات مهم تحقيقاتي در اين زمينه توليد لاينهاي هموزيگوس جهت توليد گياهان هيبريد در گونه هاي خودناسازگار  مي باشد ( نوري قنبلاني ، 1371 ) . هاپلوئيدها در بسياري از تيره ها و جنس هاي گياهان بازدانه و نهاندانه تشكيل مي شوند ( Palmer et al., 1996 )  .در طبيعت هاپلوئيدهايي كه از سلولهاي جنسي مادري به دست مي آيند فراوانتر از هاپلوئيدهاي حاصل از سلولهاي جنسي پدري مي باشند  ( Foroughi  et al., 1990    ) .                          

2-3-1 :  مزايا و كاربردهاي هاپلوئيدها :

  گياهان هاپلوئيد در اصلاح نباتات ژنتيك و مهندسي ژنتيك[17] داراي كاربرد فراواني هستند كه برخي از آنها عبارتند از :

1- در نتيجه القاي هاپلوئيدي و به دنبال آن دو برابر شدن تعداد كروموزومهاي هاپلوئيد توليد شده، امكان رسيدن سريع به هموزيگوسيتي وجود دارد و در نتيجه تحقيقات ژنتيكي و اصلاحي را آسانتر مي‌كند. در شرايط هموزيگوسيتي تفكيك ژنتيكي ساده است و آللهاي مغلوب توسط آلهاي غالب پوشيده نخواهند شد. براي اصلاح كننده اي كه با گياهان دو پايه و خود ناسازگار سر و كار دارد، توليد گياه هموزيگوس بسيار مهم است. گرچه در گياهان خودگشن از طريق خودگشني مي‌توان به هموزيگوسيتي مناسبي دست يافت، ولي براي رسيدن به هموزيگوسيتي كامل به 5 تا 10 نسل خودگشني نياز است.  در واقع يكي از مزاياي هاپلوئيدي و توليد دابل هاپلوئيد ، توليد لاينهاي خالص مي‌باشد كه در مورد گياهان داراي دگرگشني، نيز امكان پذير  مي‌باشد            ( Kasha, 2003 ) .

2- درجمعيت گياهان هاپلوئيدوجود تفرق ژنتيكي و نسبت‌هاي ژنتيكي ساده‌تر در گياهان هاپلوئيد و در نتيجه به جمعيت‌هاي كوچكي جهت مطالعات ژنتيكي ( Mohan Jain et al., 2003 ) .

3- از گياهان هاپلوئيد ميتوان در مطالعات موتاسيون استفاده كرد ( Mohan Jain et al., 2003 ) .

4- بدليل پايداري ژنتيكي رويانهاي آندروژنيك[18] و مريستم‌هاي انتهايي هاپلوئيد مي‎توان اقدام به نگهداري اين مواد و تأسيس بانك ژرم پلاسم[19] نمود ( Mohan  Jain et al., 2003; Kumar, 1995 ) .

5- از هاپلوئيدها در مطالعات سيتوژنتيك براي توليد و دستيابي به مونوسومي‌ها[20]، نالي‌سومي‌ها و آنيوپلوئيد‌ها استفاده ميشود ) Pierik., 2004 ) .  

6- از هاپلوئيد‌هاي مضاعف شده دربرنامه هاي اصلاحي به منظور شناسايي تركيبات هيبريد‌ برترمي توان . .(Pickering and Devaux , 1992 ) استفاده كرد

7- انتقال ژن پلي پلوئيدها[21] به يك گونه خويشاوند با استفاده از هاپلوئيدهاي يك گونه پلي پلوئيدامكان پذيرست ( Kasha , 2002 ) .

8- استفاده از هاپلوئيدها در بررسي پلي مورفيسم و ايجاد نقشه هاي ژنتيكي بر اساس RFLPs  در گونه هاي مختلف گياهي ( Moha Jain et al.,2003 ).

9- برطرف شدن محدوديت تهيه لاين خالص در گياهان دو پايه و خودناسازگار  ( Kumar, 1995 ).

10- استفاده از هاپلو ئيدهاي دوبل شده جهت محاسبه مقادير نو تركيبي بين ژنهاي پيوسته                                   . ( Pickering and Devaux , 1992 )

11- براي انجام امتزاج سوماتيكي ، كار كردن با پروتوپلاستهاي هاپلوئيد بسيار راحت تر از كار كردن با پروتوپلاستهاي ديپلوئيد است ( Kasha ., 2002 ) .

  2-3-2 :  مشكلات و محدوديتهاي هاپلوئيدها :

در زمينه توليد گياهان هاپلوئيد در شرايط درون شيشه‌اي ، مشكلات و محدوديتهايي نيز وجود دارد كه برخي از آنها عبارتند از :

1) عدم باززايي يا باززايي اندك رويانهاي هاپلوئيدي ( Bruins and Snijder, 1995 ).

2) مزيت توليد هاپلوئيد‌هاي مضاعف از كشت بساك تنها به ژنوتيپ‎هايي كه پاسخ مطلوب از خود نشان
 مي‎دهند ، محدود مي‌شود ( Bohanic et al., 1993 ) .

3) تشكيل كالوس به صورت خود‌به‎خودي يا القاء آن توسط مواد تنظيم‎كننده رشد، در محيط باززايي ، يك عامل محدود كننده ديگر در استفاده از رويانهاي هاپلوئيد مي‎باشد (